Полноэкзомное секвенирование ДНК человека с использованием NGS технологий

Краткое описание

Одобрен

Объединенной комиссией по качеству медицинских услуг

Министерства здравоохранения Республики Казахстан

от 13 мая 2022 года

Протокол №160

Полноэкзомное секвенирование ДНК человека с использованием NGS технологий – метод, который одновременно считывает сотни и тысячи генов за один эксперимент в сравнении с традиционным секвенированием по Сангеру, который покрывает ограниченное количество генетической информации. Метод анализирует транскрибируемые участки ДНК, где предположительно находятся около 85% всех мутаций, ассоциированных с тем или иным генетическим заболеванием [7].

КЛИНИЧЕСКИЙ ПРОТОКОЛ МЕДИЦИНСКОГО ВМЕШАТЕЛЬСТВА

ПОЛНОЭКЗОМНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ NGS ТЕХНОЛОГИЙ

ВВОДНАЯ ЧАСТЬ:

Код(ы) МКБ-10:

Дата разработки протокола: 2022 год.

Сокращения, используемые в протоколе:

Пользователи протокола: врачи-генетики, неврологи (в том числе детские неврологи), неонатологи, педиатры, врачи-дерматологи.

Категория пациентов:
дети, с подозрением на наследственные заболевания, с задержкой психомоторного развития, расстройства аутистического спектра, неврологических расстройств (эпилепсия, спиноцеребральная атаксия, нервно-мышечные заболевания и др.);
дети с наследственной генетической патологией (нейрофиброматоз, туберозный склероз, незавершенный остеогенез и др.);
взрослые в рамках пренатальной и предимплантационной генетической диагностики;
члены семей группы высокого генетического риска, являющиеся носителями мутаций [3, 11].

МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ [1-3, 6, 8-9,11]

Цель проведения процедуры и вмешательства:

Кратность применения: исследование проводится однократно.

Полноэкзомное секвенирование является генетическим тестом, который позволяет быстро и точно диагностировать:

наследственное генетическое заболевание;

мутации при задержке психомоторного развития;

мутации при расстройствах аутистического спектра, неврологических расстройствах.

Также полноэкзомное секвенирование позволяет рассчитать прогноз риска развития генетической патологии для пациента и членов его семьи [1-3, 6, 8-9].

Противопоказания к процедуре и вмешательству: нет.

Показания к процедуре и вмешательству:

Подозрение на генетическую патологию, а именно:

дети, с подозрением на наследственные заболевания, с задержкой психомоторного развития, расстройства аутистического спектра, неврологических расстройств (эпилепсия, спиноцеребральная атаксия, нервно-мышечные заболевания и др.);

дети с наследственной генетической патологией (нейрофиброматоз, туберозный склероз, незавершенный остеогенез и др.);

взрослые в рамках пренетальной и предимплантационной генетической диагностики;

члены семей группы высокого генетического риска, являющиеся носителями мутаций [3, 11].

Перечень основных и дополнительных диагностических мероприятий: не требуется.

Требования к проведению процедуры и вмешательства:

Требования к соблюдению мер безопасности, санитарно-эпидемиологическому режиму: меры безопасности и противоэпидемический режим согласно Санитарным правилам «Санитарно-эпидемиологические требования к объектам здравоохранения», утвержденным постановлением Правительства Республики Казахстан от 11 августа 2020 года № ҚР ДСМ-96/2020.

Требования к оснащению:

Для проведения полноэкзомного секвенирования ДНК человека с использованием технологии NGS потребуются:

платформы для секвенирования;

секвенатор;

автоматическая станция для выделения ДНК;

флуориметр;

центрифуга;

ламинарный шкаф;

проточный бактерицидный рециркулятор воздуха;

холодильник;

инструмент для количественного определения нуклеиновых кислот;

анализатор качества нуклеиновых кислот;

термоциклер;

вортекс плашечный;

обычные лабораторные принадлежности (пипетки, 96-луночные планшеты, центрифужные пробирки).

Методика проведения процедуры [9]:

Полноэкзомное секвенирование ДНК человека с использованием NGS технологий представляет собой несколько этапов, включающих фрагментирование цепочки ДНК, дальнейшую прицепку биотинилированных олигонуклеотидов, которые прикрепляются к экзомам [9]. Далее, магнетические частицы стрептавидина прикрепляются к биотинилированным олигонуклеотидам и отправляются на полимеразную цепную реакцию для увеличения количества фрагментов ДНК, тогда как неприкрепленные участки (неэкзомы) смываются в ходе процесса подготовки. После этого полученные цепочки ДНК в ходе полимеразной цепной реакции считываются секвенатором для дальнейшего биоинформатического анализа [6].

Данная процедура проводится в соответствии с утвержденными стандартными операционными процедурами организации и руководством по протоколу NGS используемой технологии.

I этап: Подготовка библиотеки* [8, 9]:

Подготовка библиотеки состоит из следующих шагов:
выделение образца ДНК;
ПЦР-амплификация ДНК;
очистка библиотеки.

«Библиотека» - для параллельного высокопроизводительного секвенирования ДНК должна быть специальным образом подготовлена. Её нужно «нарезать» на фрагменты определённой длины и прикрепить к каждому фрагменту особую метку, которая нужна для нескольких этапов непосредственного секвенирования в приборе и последующей обработки «сырых» данных.

II этап: Секвенирование

Чтение каждой нуклеотидной последовательности ДНК в зависимости от характеристик генетического анализатора (секвенатора нового поколения – NGS). Длина прочтений зависит от технических возможностей секвенатора. Не все модели секвенаторов позволяют проводить секвенирование экзома.

III этап: Биоинформационный анализ

Производится биоинформационный анализ полученных данных и лабораторная интерпретация полученных результатов. Биоинформационный анализ проводится специалистами с соответствующей подготовкой (врач-генетик, биоинформатик).

IV этап: Выдача заключения врачом-генетиком по результатам анализа.

Таблица 1. Этапы проведения процедуры полноэкзомного секвенирования.

Общая длительность проведения процедуры составляет 170-199 часов и проводится в несколько этапов.

Индикаторы эффективности процедуры:

Ожидаемый эффект от внедрения: нахождение мутаций в генах, ассоциированных с заболеванием, для:

подтверждения генетического диагноза;

пренатальной и предимлантационной генетической диагностики;

назначения таргетной терапии;

возможной дальнейшей корректировки лечения пациентов [1-3, 6, 8-9].