Инвазивная пренатальная диагностика в группах повышенного генетического риска

Краткое описание

Одобрен

Объединенной комиссией по качеству медицинских услуг

Министерства здравоохранения Республики Казахстан

от «28» июня 2024 года

Протокол №210

КЛИНИЧЕСКИЙ ПРОТОКОЛ МЕДИЦИНСКОГО ВМЕШАТЕЛЬСТВА

ИНВАЗИВНАЯ ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА В ГРУППАХ ПОВЫШЕННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО РИСКА

Инвазивная пренатальная диагностика (далее – ИПД) – методы диагностики хромосомной и моногенной патологии у плода, осуществляемые путем внутриматочного прокола с забором материала плодового происхождения для цитогенетического, молекулярно-цитогенетического или молекулярно-генетического анализа [1].

Кратность применения: исследование проводится однократно.

Техника проведения: биопсия хориона, плацентоцентез, амниоцентез, кордоцентез.

ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

Код(ы) МКБ-10:

Дата разработки/пересмотра протокола: 2023 год.

Сокращения, используемые в протоколе:

Пользователи протокола: медицинские генетики, акушер-гинекологи.

Категория пациентов: беременные, относящиеся к группе высокого (≥150) и промежуточного риска (отсечка 1:100-1:1000) по хромосомной аномалии после прохождения комбинированного теста первого триместра (11 недель – 13 недель 6 дней) и ультразвукового скрининга в сроке 19-21 недель в рамках пренатального скрининга [1]; при известном семейном носительстве патологичных генов некоторых моногенных заболеваний, таких как Спинальная мышечная амиотрофия, миодистрофия Дюшенна-Беккера и др.

МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ [1]

Цель проведения процедуры/вмешательства:

Исключение хромосомной или моногенной патологии плода.

Показания и противопоказания к проведению процедуры/ вмешательства:

Показания к проведению процедуры/вмешательства:

 Возраст беременной женщины 37 лет и старше;

 Наличие в анамнезе случаев рождения ребенка с ВПР или хромосомной патологией;

 Семейное носительство хромосомных или генных мутаций;

 Выявление анатомических аномалий развития плода при проведении ультразвукового скрининга;

 Обнаружение ультразвуковых маркеров хромосомной патологии у плода при проведении ультразвукового скрининга;

 Индивидуальный генетический риск после прохождения комбинированного теста первого триместра 1:150 и выше.

Противопоказания к проведению процедуры/вмешательства:

 Угроза прерывания беременности;

 Акушерская патология;

 Отрицательный резус фактор у плода.

Перечень основных и дополнительных диагностических мероприятий: не требуется.

Требования к проведению процедуры и вмешательства:

Условия для проведения (соблюдение мер безопасности, санитарно-противоэпидемический режим):

 Меры безопасности и противоэпидемический режим необходимо соблюдать согласно Санитарным правилам «Санитарно-эпидемиологические требования к объектам здравоохранения», утвержденным постановлением Правительства Республики Казахстан от 11 августа 2020 года № ҚР ДСМ 96/2020.

 Требования к квалификационной категории представлены в Правилах организации скрининга, утвержденных Приказом Министра здравоохранения Республики Казахстан от 9 сентября 2010 года № 704.

 Сроки проведения ИПД:
с 11 недель 0 дней до 14 недель 0 дней беременности – биопсия ворсин хориона;
с 14 недель 0 дней до 18 недель 0 дней беременности – плацентоцентез;
с 16 недель 0 дней до 20 недель 0 дней беременности – амниоцентез;
с 20 недель 0 дней до 21 недели 0 дней беременности – кордоцентез.

Требования к оснащению:

Требования к минимальному оснащению оборудованием представлен в Стандарте организации оказания медико-генетической помощи в Республике Казахстан, утвержденном Приказом Министра здравоохранения Республики Казахстан от 14 сентября 2023 года № 149.

Приготовление растворов и реагентов [2]

Рабочий раствор гепарина – раствор гепарина 5000 МЕ/мл, необходимо развести с дистиллированной водой 1:20 соответственно.

Рабочий раствор колхицина – 0,01 г колхицина на 10 мл дистиллированной воды. Хранить при +4оС в течение года.

Гипотонический раствор – 0,9% натрий лимоннокислый трёхзамещённый (цитрат натрия) – 90 мг соли растворить в 10 мл дистиллированной воды.

В чистые флаконы вносится по 4,0 мл гипотонического раствора и 0,4 мл рабочего раствора колхицина. Флаконы помещаются в термостат при 37°С.

Фиксатор – смесь этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1, соответственно. Фиксатор охлаждается в морозильной камере.

60% раствор уксусной кислоты – 3,0 мл ледяной уксусной кислоты + 2 мл дистиллированной воды.

Примечание: фиксатор, гипотонический раствор, 60% раствор уксусной кислоты следует готовить в день использования.

Раствор трипсина: 25 мг порошка трипсина растворить в 100 мл буфера для трипсина (pН 7,2-7,3).

Буфер для трипсина (pH 7,2-7,3): растворить в 1000 мл дистиллированной воды:

8 г NaCl;

0,4 г КС1;

0,725 г Na2HP04;

0,12 г КН2Р04.

проверить значение pH. Раствор хранится при комнатной температуре до 1 месяца.

Буфер для краски (pH 6,8): растворить в 1000 мл дистиллированной воды 8 г NaCl;

0,2 гКС1; l,15rNa2HP04;

0,2 г КН2Р04

проверить значение pH. Раствор хранится при комнатной температуре до 1 месяца.

Методы приготовления препаратов хромосом:

 Приготовление препаратов хромосом из лимфоцитов пуповинной крови плода представлено в приложении 1.

 Приготовление препаратов хромосом из ворсин хориона/плаценты представлено в приложении 2.

 Протокол культивирования амниотической жидкости в CO2 инкубаторе представлен в приложении 3.

 Протокол культивирования амниотической жидкости без инкубатора CO2 представлен в приложении 4.

 Приготовление препаратов хромосом и интерфазных клеток для гибридизации представлено в приложении 5.

 Правила забора ворсин хориона и плаценты для проведения молекулярно-генетических исследований представлены в приложении 6.

Индикаторы эффективности процедуры/вмешательства [5]:

Рекомендации по минимальному уровню разрешения дифференциальной окраски в зависимости от показаний для исследования

*При обнаружении нормального кариотипа в случае выраженной клинической картины (множественные врожденные пороки и/или аномалии развития, умственная отсталость) для уточнения диагноза желательно использование молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических технологий
* Система оценки качества G-окраски, рекомендации по минимальному количеству метафазных пластинок/интерфазных ядер, необходимых для проведения цитогенетического/молекулярно-цитогенетического исследования и минимальное число метафазных пластинок/интерфазных ядер, необходимых для исследования, в зависимости от ДНК-зонда представлены в приложениях 7, 8 и 9.

Приложение 1

Приготовление препаратов хромосом из лимфоцитов пуповинной крови плода

Особенностью пренатальной диагностики с использованием крови плода, полученной путем кордоцентеза из пуповинной вены, является ограниченное количество (не более 1мл) получаемого материала и необходимость исключения контаминации клетками крови материнского происхождения. Получение крови из пуповины плода осуществляют в операционной путем трансабдоминального кордоцентеза [7].

Тест для оценки контаминации пуповинной крови плода кровью матери (Apt-test) [8]

1. В пробирку, содержащую 5,0 мл дистиллированной воды, добавить 1,0 мл 0,25 N NaOH (смешивать непосредственно перед применением);
2. Добавить 0,05 мл крови (1-2 капли), перемешивать покачиванием пробирки в течение 1 мин.

Интерпретация: переход цвета смеси от розового до темного зелено-коричневого указывает на присутствие в образце крови матери. Ярко-розовый цвет свидетельствует об отсутствии контаминации.

Протокол культивирования клеток пуповинной крови

1-этап: Приготовление культуральной среды и посадка материала

Способ 1.

1. В 2 (две) пробирки культуральные со скошенным дном или пробирки типа Фалкон конические стерильные объемом 15 мл добавить:
   1.  фетогемагглютинин (ФГА) в концентрациях, рекомендуемых фирмой-производителем;
   2.  гепаринизированную пуповинную кровь 0,5 мл;
   3.  среды для культивирования RPMI-1640 – 6,0 мл;
   4.  сыворотка крупного рогато скота - 1,5 мл.
2. Пробирки поместить в термостат для культивирования, стандартное время культивирования – 72 часа при температуре +37⁰С в закрытой системе.
3. За 1 час до окончания культивирования во флакон добавьте 0,3 мл 10 γ колхицина на 1-3 часа*.
4. По окончании инкубации с колхицином культуральную смесь центрифугируйте 10 мин при 1000 об/мин.

Способ 2.

В 2 (две) пробирки культуральные с дном платформой или пробирки типа Фалкон конические стерильные объемом 15 мл добавить:

 готовую заводскую культуральную среду - 5,0 мл;

 гепаринизированную пуповинную кровь - 0,5 мл.

2-этап: Гипотонизация и фиксация препаратов

1. Гипотонизация

 удалите пипеткой супернатант (надосадочная жидкость), оставьте 0,3-0,5 мл над осадком. Разбейте осадок энергичным встряхиванием и добавьте 8 - 10 мл гипотонического раствора (0,55%-1 раствор KCl, 1:1), перемешайте пипетированием и инкубируйте в термостате 15-20 минут при +37⁰С*;

 центрифугируйте 10 мин при 1000 об/мин;

 удалите пипеткой супернатант (надосадочная жидкость), оставьте 0,3-0,5 мл над осадком.

2. Фиксация

2.1 Вариант 1.

 разбейте тщательно осадок на вортексе. Влейте струйно 8-10 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (этанол + ледяная уксусная кислота, 3:1) и перемешайте пипетированием;

 центрифугируйте 10 мин при 1000 об/мин;

 удалите пипеткой супернатант (надосадочная жидкость), оставьте 0,3-0,5 мл над осадком. Фиксацию культуры проводят три раза.

2.2 Вариант 2 (с предфиксацией)

 по окончании времени гипотонической обработки в каждую пробу добавь по 0,5-1,0 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (этантеол + ледяная уксусная кислота, 3:1), перемешайте пипетированием и осадите центрифугированием (10 мин,1000об/мин);

 удалите супернатант, разбите осадок встряхиванием и проведите фиксацию как описано в варианте 1.

2.3 Вариант 3 (с предфиксацией)

 по окончании времени гипотонической обработки в каждую пробу добавьте по 2 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (этанол + ледяная уксусная кислота, 3:1), перемешайте пипетированием и осадите центрифугированием (8 мин, 1500 об/мин);

 удалите супернатант, разбите осадок встряхиванием и проведите фиксацию как описано в варианте 1.

3-этап: Приготовление стеклопрепаратов

После завершения фиксации суспензию клеток (0,5-1,0 мл) ресуспендируют пипеткой Пастера, чтобы суспензия клеток в фиксаторе имела опалесцирующий вид (слегка мутноватая). Из полученной суспензии клеток готовят препараты путем раскапывания ее на холодные обезжиренные влажные предметные стекла. Храните предметные стекла в холодильнике в дистиллированной воде:

1. Нанесите клеточную суспензию на влажное стекло пипеткой Пастера с высоты около 30 см под углом 45° (по 3 - 4 капли) на стекло*.
2. Поместите стеклопрепараты в термостат при 37°С на 12 час, затем переключите на 60°С в течение 2 - 3 часа*.
3. Покрасьте стеклопрепарат:
   1.  поместите стеклопрепарат в 1 сосуд Коплина с 0,25% раствор Трипсина на 2 минуты;
   2.  перенесите стеклопрепарат на покрасочную поверхность и добавьте раствор краски.

Расчет объема краски на 1 стеклопрепарат:

 100 мкл краситель Гимза;

 5 мл PBS – буфер.

– адаптируйте к условиям цитогенетической лаборатории

4-этап: Анализ стеклопрепарата

Критерии выбора метафазной пластины [8]:

 все хромосомы должны быть хорошо прокрашенными и равномерно разбросаны. Густота их расположения в различных участках не должна отличаться более чем в два раза;

 не допускается наличия нескольких случайных хромосом в поле зрения;

 форма метафазной пластинки по периферии должна быть округлой или овальной, но в последнем случае ее большой диаметр должен быть не более двух малых акроцентрических хромосом;

 уровень конденсации хромосом должен находиться в следующих пределах: максимум – малые ацентрические хромосомы видны в виде четко выраженных структур, а не виде точек, минимум – хромосомы разделены на две хроматиды и лежат отдельно друг от друга;

 не допускается наличия в метафазной пластине хромосом, которые уже вступили в колхициновую анафазу;

 не допустим анализ метафазных пластин с продольным наложением больших и средних хромосом, а также любое наложение малых. Допускается только поперечное положение длинных плеч.

5-этап: Оформление результатов цитогенетического исследования с использованием правил оформления хромосомных нарушений [9].

Приложение 2

Приготовление препаратов хромосом из ворсин хориона/плаценты

Получение, хранение и транспортировка материала [8].

Забор плодного материала проводится под контролем ультразвукового исследования в амбулаторных условиях, не требует премедикации и анестезии. Непосредственно в операционной биоптат из шприца переносится в чашку Петри со средой (+30-37°С) и гепарином. Отбор ворсин проводится глазным пинцетом, визуально оценивается количество полученного материала со стандартом. В лаборатории имеется заранее приготовленный стандарт, несколько пробирок с различным объемом ворсин хориона/плаценты: 2 мг, 5 мг, 10 мг.

Получение материала

1. Присвойте каждому образцу соответствующий номер, отражающий порядковый номер поступления и дату получения на всех этапах обработки и анализа материала.
2. Перенесите биоптат из шприца в чашку Петри (диаметром 100 мм) со средой (4,0 мл 0,9% физраствора и несколько капель гепарина (25 000 единиц).
3. Оцените визуально количество и качество материала, сравните со стандартом.

Ускоренный «прямой» метод

1-этап. Гипотонизация

 Перенесит отмытый от крови материал ворсина хориона/плаценты (по 5-10 мг) в пенициллиновые флаконы с раствором для гипотонизации: 4 мл 0,9 % трехзамещенного цитрата натрия и колхицина в конечной концентрации 2,5 мкг/мл 0,4 мл 100γ (stock solution – маточный раствор);

 Провидите гипотоническую обработку при комнатной температуре 40-50 минут или при температуре +37°С 35-45 минут*.

2-этап. Предфиксация

 проведите предфиксацию при комнатной температуре.

 перенесите пеницилиновые флаконы с биоматериалом из термостата на стол и добавить 2 мл фиксатора (этанол + ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1);

 инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 мин.

3-этап. Фиксация

 удалите пипеткой Пастера из флакона ½ префиксирующего раствора, добавьте 4,0 мл холодного (+4⁰С) фиксатора. Время фиксации 10 минут при температуре – 10-15⁰С*;

 удалите весь префиксирующий раствор через 10 минут;

 добавьте 4,0 мл (+4°С) фиксатора. Время фиксации - 20 минут при -10-15°С*;

 удалите фиксирующий раствор и снова добавьте фиксатор. Время фиксации - 20 минут при -10-15°С;

 налейте в чистый пенициллиновый флакон 4,0 мл свежего фиксатора, поместите в него ворсины хориона/плаценты и добавьте равный объем дистиллированной воды (4,0 мл). Время постфиксации: 2-5 минут, контроль процесса: ворсины опустятся на дно (от этого зависит разброс хромосом);

 удалите пипеткой Пастера всю жидкость;

 переверните флаконы вверх дном на фильтровальную бумагу для удаления остатков фиксатора, ворсины должны остаться на стенках флакона;

 добавьте во флаконы с ворсинами хориона/плаценты 4-5 капель 60% ЛУК (6,0 мл ЛУК+ 4,0 мл Н2О);

 Способ 1. Соберите пипеткой Пастера клеточную взвесь, нанесите взвесь на чистые сухие подогретые, в термостате или над пламенем горелки до +45-50°С предметные стекла. Держите предметные стекла под наклоном. Избыток суспензии перенести на следующий препарат.

 Способ 2. Перенесите ворсину хориона на предметное стекло, добавьте несколько 4-5 капель 60% ЛУК. Через 2-3 мин ворсину перенести на следующее предметное стекло в каплю уксусной кислоты, распределите суспензию клеток на первом стекле покачиванием по поверхности стекла.

1-этап. Постфиксация:

 Нанесите 1-2 капли фиксатора на предметное стекло;

 Высушите над пламенем спиртовки или подожгите фиксатор;

 Перенесите стекло препараты в термостат на ночь*.

2-этап. Окраска стеклопрепаратов

Окрашивание предметных стекол проводится по стандартной методике с помощью раствора красителя Гимза с предварительной обработкой стекол 0,25% раствором трипсина для получения дифференциальной GTG-окраски.

1. Расчет раствора краски*:

Перенесите стеклопрепарат на покрасочную поверхность и добавьте раствор краски. Пример:

2. Расчет объема раствора краски на 1 стеклопрепарат:

 100 мкл краситель Гимза;

 10 мкл 0,25% раствора Трипсина;

 PBS – буфер, рассчитывается в зависимости от количества стекол: 3мл на 1 стекло;

 время окраски 20 мин.

*– адаптируйте к условиям цитогенетической лаборатории
Примечания

 Митотический индекс не зависит от морфологии ворсины, поэтому не следует пренебрегать ворсинами, не имеющими выраженной васкуляризации;

 Качество метафазных хромосом существенно зависит от гипотонической обработки, поэтому необходимо заблаговременно апробировать каждую новую партию цитрата натрия;

 Гипотонический раствор, как и 60%-й раствор уксусной кислоты следует готовить в день использования;

 Препараты следует готовить непосредственно в день забора материала, при увеличении срока хранения фиксированного материала значительно ухудшается их качество;

 Из образца весом до 5 мг делать не более двух препаратов.

Критерии выбора метафазной пластины см в разделе «Приготовление препаратов хромосом из лимфоцитов пуповинной крови».

Приложение 3

Протокол культивирования амниотической жидкости в CO2 инкубаторе

Культура амниотической жидкости:

 стерильные условия (ламинарный бокс);

 амниотическую жидкость отбирают в количестве 21 мл в операционной, помещают в стерильный пластиковый культуральный флакон SPL (объем 25 см2, вентилируемая крышка с фильтром), транспортируют в лабораторию.

Посадка культуры:

 разлейте амниотическую жидкость по 7 мл в стерильные пластиковые конические пробирки объемом 15 мл (по 3 флакона на каждый образец амниотической жидкости);

 центрифугируйте пробирки 7 мин при 1500 об/мин;

 удалите супернатант;

 оставьте в пробирке 2 мл амниотической жидкости с осадком клеток;

 осадок ресуспензировать;

 добавьте 5 мл питательной среды для культивирования амниотической жидкости (в соотношении исходная проба: среда, равном 1,4:1);

 перенести суспензию клеток со средой в культуральные флаконы с вентилируемой крышкой с фильтром (V 25см2);

 инкубировать в культуральных флаконах 5 дней при 37°C (5% CO2).

Промежуточная смена питательной среды

Проводится через 5 дней в стерильных условиях с предварительной обработкой клеток раствором Хенкса в соотношении 2,3:1, последующие смены среды осуществляют через каждые 2 дня.

 удалите среду из флаконов, клетки промыть с 3 мл раствора Хенкса;

 обработку проведите дважды;

 добавьте 5 мл среды в каждый флакон;

 инкубируйте флаконы при 37°C (5% CO2).

Трипсинизация

Для получения синхронизированной культуры клеток в флакон добавьте 0,05% раствора трипсин-ЭДТА: в первый флакон через 6 дней от начала культивирования, во втором - через 7 дней, в третий - через 8 дней:

 слейте питательную среду;

 добавьте во флакон теплый (37°C) раствор трипсин-ЭДТА (3 мл) на 20 с;

 слейте раствор трипсин-ЭДТА;

 обработку проведите дважды;

 подождите 30 секунд, энергично встряхните флакон. Отделение клеток от дна флакона контролируйте под инвертированным микроскопом. Общее время обработки клеток трипсином-ЭДТА составляет 2-3 мин;

 после отделения клеток во флакон добавьте питательную среду (5 мл).

Смену среды проводят во всех флаконах через сутки после трипсинизации.

Фиксация

 проводится через 19 часов после финальной замены питательной среды;

 добавьте в культуру клеток раствор колхицина (конечная концентрация 1 мкг/ мл) в течение 2,5 часов при 37°C, 5% CO2;

 слейте среду из флакона в центрифужную пробирку;

 обработайте культуральный флакон теплым (37°C) 0,05% раствором трипсин-ЭДТА (3 мл);

 встряхните флакон, контролируйте отделение клеток от дна флакона под микроскопом;

 слейте раствор трипсин-ЭДТА с отделившимися клетками в ту же центрифужную пробирку;

 обработку культурального флакона провести дважды;

 центрифугируйте пробирку 7 мин при 1500 об/мин;

 удалите супернатант.

Общее время обработки клеток 0,05% раствором трипсин-ЭДТА составляет 2-3 мин.

Гипотонизация

 добавьте в пробирку 10 мл теплого (37°C) гипотонического раствора (вода, эмбриональная телячья сыворотка 2:1) для наполнения клеток водой и лучшего распластывания хромосом при приготовлении препаратов;

 пипетируйте;

 флаконы поместите в термостат на 20 мин при 37°C;

 добавьте 5 капель фиксатора, пипетируйте;

 центрифугируйте пробирку 7 мин при 1500 об/мин;

 удалите супернатант;

 добавьте 7 мл фиксатора (этанол, уксусная кислота 3:1) для фиксации;

 поместите флакон в холодильник на 40 мин при 4°C.

Приготовление препаратов хромосом

Готовятся методом in situ на стеклах из клеток, культивированных в слайд-флаконах:

 центрифугируйте пробирку 7 мин при 1500 об/мин;

 удалите супернатант, оставив 1 мл с осадком;

 добавьте фиксатор до 2-2,5 мл (в зависимости от осадка), пипетируйте;

 раскапайте суспензию на обезжиренные, холодные, влажные предметные стекла;

 высушите полученные препараты в течение 20 мин под струей теплого воздуха;

 окрашивание предметных стекол проводится по стандартной методике с помощью раствора красителя Гимза с предварительной обработкой стекол 0,25% раствором трипсина для получения дифференциальной GTG-окраски;

 цитогенетический анализ кариотипа для каждого пациента должен быть сделан не менее, чем в 20 метафазных пластинках хромосом, полученных из трех отдельных культуральных слайд-флаконов.

Показатель митотического индекса определяется как отношение количества метафазных пластинок, приходящееся на общее количество в 1000 ядер, выраженное в процентах. Высоким митотическим индексом считается 4-6,9% (от 40 до 69 метафаз на 1000 ядер).

Приложение 4

Протокол культивирования амниотической жидкости без инкубатора CO2

Культура амниотической жидкости:

 стерильные условия (ламинарный бокс)

Посадка культуры:

 проводится в культуральные слайд флаконы с невентилируемой крышкой (по 2 флакона на каждый образец амниотической жидкости);

 в каждый слайд-флакон разливается 10 мл амниотической жидкости и добавляется по 5 мл питательной среды AmnioMAX-II;

 слайд-флаконы помещаются в термостат при температуре 37°С на 4-5 дней.

Промежуточная смена питательной среды:

 проводится через 4-5 дней в стерильных условиях;

 из слайд-флакона сливается вся жидкость и добавляется по 5 мл новой питательной среды AmnioMAX-II;

 слайд-флаконы помещаются в термостат при температуре 37°С;

 через 3-4 дня после смены питательной среды оценивается рост культуры под стереомикроскопом.

Финальная замена питательной среды:

 проводится на 4-й день после промежуточной замены питательной среды при условии, что размер колоний клеток достигает 2-4 мм;

 из слайд-флакона сливается вся жидкость и добавляется по 3 мл новой питательной среды AmnioMAX-II;

 слайд-флаконы помещаются в термостат при температуре 37°С на 16 часов.

Фиксация культуры амниотической жидкости

Процедура проводится в вытяжном шкафу

 проводится через 16 часов после финальный замены питательной среды;

 в слайд-флакон добавляется по 1 капле (0,3 мкл) раствора колхицина для остановки клеточного деления. Флаконы помещаются на 2 часа в термостат при температуре 37°С;

 из слайд-флакона сливается вся жидкость и добавляется по 1 мл теплого раствора трипсин-версена, который должен покрыть все дно флакона, оставить на 1 минуту;

 в слайд-флакон с раствором трипсин-версена добавляется 8 мл гипотонического раствора, жидкость перемешивается и помещается в термостат при температуре 37°С на 8 минут;

 в слайд-флакон добавляется 2 мл раствора фиксатора, жидкость перемешивается и оставляется при комнатной температуре на 3 минуты;

 в слайд-флакон добавляется еще 3 мл раствора фиксатора, жидкость перемешивается и оставляется при комнатной температуре на 4 минуты;

 для каждого слайд-флакона готовится отдельная центрифужная пробирка объемом 15 мл и скребок;

 с помощью скребка со стенок слайд-флакона отделяются все колонии клеток;

 суспензия раствора и клеточных колоний переливается из флакона в центрифужную пробирку (общий объем жидкости около 14 мл);

 пробирка центрифугируется 4 минуты при скорости 2000 об/мин;

 параллельно с центрифугированием пробирки, в слайд-флакон добавляется 3 мл раствора фиксатора, жидкость перемешивается;

 из центрифужной пробирки с помощью пипетки удаляется супернатант до остаточного объема 1,5 мл; осадок бережно взбалтывается и в него из слайд-флакона переливается фиксатор с остатками клеток;

 в слайд-флакон еще раз добавляется 3 мл раствора фиксатора, отмываются все остатки клеток, раствор сливается в центрифужную пробирку (общий объем жидкости около 7,5 мл);

 пробирка помещается в холодильник на 20 минут;

 пробирка центрифугируется 4 минуты при 2000 об/мин;

 из центрифужной пробирки с помощью пипетки удаляется супернатант до остаточного объема 1,5 мл, осадок бережно перемешивается;

 в пробирку добавляется 5 мл раствора фиксатора, пробирка помещается в холодильник на 1 час;

 пробирка центрифугируется 4 минуты при 2000 об/мин;

 из центрифужной пробирки с помощью пипетки удаляется супернатант до остаточного объема 1,5 мл, осадок перемешивается;

 в пробирку добавляется 8 мл раствора фиксатора, пробирка помещается в холодильник на 18-22 часа.

Приготовление хромосомных препаратов

Готовятся методом in situ на покровных стеклах из клеток, культивированных в слайд-флаконах:

 пробирка центрифугируется 4 минуты при 2000 об/мин;

 из центрифужной пробирки с помощью пипетки удаляется супернатант до остаточного объема 1,0 мл;

 супернатант раскапывается на охлажденные мокрые предметные стекла под наклоном;

 стекла подсушиваются при комнатной температуре и помещаются на термостолик, где полностью высушиваются в течение 1 часа при температуре 90°С;

 после сушки предметные стекла помещаются в термостат при температуре 37°С на 1-2 часа. После этого стекла готовы к покраске;

 окрашивание предметных стекол проводится по стандартной методике с помощью раствора красителя Гимза с предварительной обработкой стекол 0,25% раствором трипсина для получения дифференциальной GTG-окраски;

 цитогенетический анализ кариотипа для каждого пациента должен быть сделан не менее, чем в 20 метафазных пластинках хромосом, полученных из двух отдельных культуральных слайд-флаконов.

Приложение 5

Приготовление препаратов хромосом и интерфазных клеток для гибридизации

Для приготовления гибридизации in situ пригодны цитологические или гистологические препараты клеток любых тканей или органов, приготовленные по стандартным методикам. В условиях клинической цитогенетической лаборатории используют препараты культивированных лимфоцитов периферической крови, клеток цитотрофобласта хорионального эпителия, культивированных и некультивированных клеток амниотической жидкости, различных тканей из абортного материала.

Способ 1

1. Образец амниотической жидкости разлейте в пробирки типа Фалкон с закручивающейся крышкой;
2. Центрифугируйте пробирку при 1000-1500об/мин в течении 5 минут;
3. Удалите супернатант;
4. Добавьте 3 мл раствора трипсина 0,05% с ЭДТА (2:8+1 вакутейнер 2 мл с ЭДТА);
5. Инкубируйте на водяной бане 5 минут при 37°С;
6. Центрифугируйте 5 минут при 1000-1500 об/мин;
7. Удалите супернатант;
8. Осторожно по стенке пробирки внесите 1 мл PBS-буфер и 1 мл холодного фиксатора Карнуа (предпочтительнее приготовить его de novo из 96% спирта и ледяной уксусной кислоты), тщательно пипетируйте;
9. Центрифугируйте 5 минут при 1000-1500 об/мин;
10. Удалите супернатант;
11. Добавьте 3 мл холодного фиксатора, пипетируйте осторожно до 10 раз;
12. Инкубируйте 10 минут при комнатной температуре;
13. Центрифугируйте 5 минут при 1000-1500 об/мин;
14. Удалите супернатант;
15. Наносите по 5 мк ресуспендированного осадка на охлаждённые предметные стекла.

Способ 2

Приготовление препаратов некультивированных клеток амниотической жидкости

1. Образец амниотической жидкости по 6-8 мл перенести в центрифужные пробирки и центрифугировать при 1000 об/мин в течение 10 мин;
2. Удалите пипеткой осторожно надосадочную жидкость, добавьте к осадку 8 мл гипотонического раствора и пипетируйте;
3. Инкубируйте смесь 1,5 часа в термостате при +37⁰С;
4. Центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 10 мин;
5. Удалите пипеткой осторожно надосадочную жидкость;
6. Фиксируйте материал дважды свежеприготовленным фиксатором (этанол + ледяная уксусная кислота, 3:1). Проводите фиксацию при +4⁰С, первую в течение 10 мин, вторую – 20 мин;
7. Осадите клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин;
8. Удалите пипеткой осторожно надосадочную жидкость;
9. К осадку добавьте ледяную уксусную кислоту, объем 8 мл на пробирку, перемешайте и выдержите пробирки при +4⁰С в течение 1,5 часов;
10. Осадите клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 1 мин, и осторожно удалите надосадочную жидкость;
11. Добавьте к осадку 10 мл свежеприготовленного фиксатора, пипетируте и инкубируйте в течение 10 мин при температуре +4⁰С;
12. Осадите клетки центрифугированием – 10 мин при 1000 об/мин, и осторожно удалите надосадочную жидкость;
13. Добавьте к осадку 6 мл охлажденного этанола, перемешайте и инкубируйте при температуре +4⁰С;
14. Осадите клетки центрифугированием – 10 мин при 1000 об/мин, и осторожно удалите надосадочную жидкость;
15. Добавьте к осадку 1,5-2 мл охлажденного этанола и пипетеруйте;
16. Суспензию клеток по 50-100 мкл раскапайте на охлажденные чистые и обезжиренные стекла и высушите поджиганием фиксатора.

Добавление FISH зондов согласно протоколу производителя.

Приложение 6

Правила забора ворсин хориона и плаценты для проведения молекулярно-генетических исследований

Для того, чтобы использовать ворсины хориона или плаценты для выделения ДНК для молекулярно-генетических исследований, они не должны подвергаться какой-либо предварительной обработке. Сразу после экстракции материал в количестве 5-20 мг должен быть помещен в пробирку с изотоническим раствором (физраствором) и в таком виде доставлен в лабораторию при температуре 4°С. Не следует замораживать пробирку с материалом. Направьте ворсинки в лабораторию в тот же день. Если нет возможности доставить ворсинки в тот же день, храните на ночь в физрастворе в холодильнике.

Материал должен быть доставлен в лабораторию в течении 24 часов.

Приложение 7

Система оценки качества G-окраски

Приложение 8

Рекомендации по минимальному количеству метафазных пластинок/интерфазных ядер, необходимых для проведения цитогенетического/молекулярно-цитогенетического исследования

Примечание: а – в том числе полностью проанализированных метафазных пластинок (посегментное сравнение гомологов на уровне 550 бэндов) не менее 3-х.

b – одна культура, если применяются другие методы детекции анеуплоидии (FISH или молекулярно-генетические)

с – может потребоваться подсчет дополнительных клеток, чтобы исключить мозаицизм или аномалию, обнаруженную в одной клетке.

d – для исключения мозаицизма или аномалии в одной клетке

е – для каждого зонда из набора для скрининга анеуплоидий.

Расширение анализа или увеличение числа проанализированных клеток обосновано, если есть клинические указания или подозрение на мозаицизм.

Приложение 9

Минимальное число метафазных пластинок/интерфазных ядер, необходимых для исследования, в зависимости от ДНК-зонда

Одним из подходов к анализу пролиферации клеток является определение митотического индекса (МИ), величина которого характеризует долю клеток, находящихся в митозе. Митотический индекс определяется как отношение количества клеток популяции, подвергающихся митозу, к общему количеству клеток. Митотический индекс — это количество клеток, подвергшихся митозу, деленное на общее количество клеток.